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青霉素對溶血性鏈球菌等鏈球菌屬，肺炎鏈球菌和不產青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。對腸球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉棒狀桿菌、炭疽芽孢桿菌、牛型放線菌、念珠狀鏈桿菌、李斯特菌、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體對注射用青霉素鈉敏感。注射用青霉素鈉對流感嗜血桿菌和百日咳鮑特氏菌亦具一定抗菌活性，其他革蘭陰性需氧或兼性厭氧菌對注射用青霉素鈉敏感性差。注射用青霉素鈉對梭狀芽孢桿菌屬、消化鏈球菌厭氧菌以及產黑色素擬桿菌等具良好抗菌作用，對脆弱擬桿菌的抗菌作用差。

青霉素通過抑制細菌細胞壁合成而發揮殺菌作用。

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